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Jun 20, 2023

Teilchenfusion von Super

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13327 (2023) Diesen Artikel zitieren 1591 Zugriff auf 2 Altmetric Metrics-Details Die Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie bietet eine Auflösung nahezu bis hinunter zu

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13327 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Lokalisierungsmikroskopie einzelner Moleküle bietet eine Auflösung nahezu bis auf molekularer Ebene mit spezifischer molekularer Markierung und ist daher ein vielversprechendes Werkzeug für die Strukturbiologie. In der Praxis wird der tatsächliche Wert dieses Bereichs jedoch hauptsächlich durch die unvollständige Fluoreszenzmarkierung der Struktur begrenzt. Diese fehlenden Informationen können durch die Zusammenführung von Informationen aus vielen strukturell identischen Partikeln in einem Partikelfusionsansatz ähnlich der Kryo-EM-Einzelpartikelanalyse ergänzt werden. In diesem Artikel präsentieren wir eine Datenanalyse der Partikelfusionsergebnisse von fluoreszierend markierten Nup96-Nukleoporinen im Kernporenkomplex, um zu zeigen, dass Nup96 in einer räumlichen Anordnung von zwei Ringen zu je 8 Einheiten mit zwei Nup96-Kopien pro Einheit auftritt, was insgesamt 32 Nup96 ergibt Kopien pro Pore. Wir nutzen die durch künstliche Intelligenz unterstützte Modellierung in Alphafold, um das bestehende Kryo-EM-Modell von Nup96 zu erweitern, um die Positionen der Fluoreszenzmarkierungen genau zu bestimmen und zu zeigen, dass die Genauigkeit der Übereinstimmung zwischen Fluoreszenz- und Kryo-EM-Daten besser als 3 nm in der Ebene ist und 5 nm außerhalb der Ebene.

Der Nuclear Pore Complex (NPC) ist eine wesentliche molekulare Maschine, die in die Kernhülle eingebettet ist und den Kern mit dem Zytoplasma verbindet1,2,3. Der NPC fungiert als Diffusionsbarriere, die das Kernkompartiment vom Zytoplasma trennt und als Tor für die Genregulation fungiert4,5. Es ist unverzichtbar bei eukaryontischen Zellprozessen wie der Regulierung des Transports von Proteinen und Ribonukleoprotein4,6,7. Die Struktur und molekulare Zusammensetzung des NPC, insbesondere des Gerüsts, wurde eingehend untersucht. Frühere Studien zur kryogenen Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) haben die Struktur des NPC-Gerüsts mit hoher Auflösung aufgelöst1,2,3,8,9,10,11. Das Gerüst besteht aus mehreren Kopien von etwa 34 verschiedenen Nukleoporinen (Nups), und diese Nups sind in drei Ringen organisiert12,13,14. Frühere Studien haben gezeigt, dass der Zytoplasmaring (CR) und der Kernring (NR) aus mehreren sogenannten Y-Komplexen bestehen und dass Nup96-Proteine ​​in diesen Y-Komplexen enthalten sind10,15. Jeder Ring enthält 16 Nup96-Moleküle, die in Einheiten mit achtfacher Rotationssymmetrie organisiert sind15,16,17.

Die hochauflösende Mikroskopie entwickelt sich zu einer ergänzenden Technik zur Untersuchung biologischer Strukturen, da sie eine „beugungsunbegrenzte“ Auflösung bietet18,19,20. Die Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM) ist eine dieser hochauflösenden Techniken und liefert hochauflösende Bilder mit einer Auflösung von 10–20 nm durch Lokalisierung einzelner fluoreszierender Emitter18,21. Wenn viele chemisch identische Strukturen, sogenannte Partikel, abgebildet werden können, können sie registriert und zu einem „Superteilchen“ kombiniert werden. Mit dieser Strategie kann der oft schlechte Markierungsgrad jedes einzelnen Partikels gemildert werden und es können Rekonstruktionen mit einer noch besseren Auflösung als den typischen 20 nm erhalten werden22,23,24,25. In SMLM wurden verschiedene 2D-Templat-basierte Partikelfusionsmethoden angewendet, um die achtfache Rotationssymmetrie des NPC22,26,27 zu demonstrieren. Diese Methoden bergen jedoch das Risiko, Rekonstruktionen zu erzeugen, die sich an der Vorlage orientieren. Später könnte ein vorlagenfreier 2D-Registrierungsansatz die achtfache Symmetrie des NPC auf unvoreingenommene Weise offenbaren28. Diese vorlagenfreie Methode wurde auf 3D erweitert und zur Rekonstruktion der 3D-Struktur von Nup107 und Nup96 verwendet, wobei zwei phasenverschobene Ringe mit acht Blobs pro Ring sichtbar wurden29. Dieser 3D-Ansatz litt jedoch unter dem „Hot-Spot“-Artefakt, der nur durch die Anwendung von Vorkenntnissen über die achtzählige Symmetrie in einem Nachbearbeitungsschritt gemildert werden konnte. Bei einem anderen 3D-Partikelfusionsansatz wird ein Modell an die einzelnen NPCs angepasst30 und die Partikel werden in der Reihenfolge ihrer Ähnlichkeit zum Superteilchen kombiniert. Dieser Ansatz zeigt in der NPC-Rekonstruktion erwartungsgemäß auch zwei Ringe mit jeweils acht Blobs oder Clustern, aber interessanterweise sind einige der Blobs in der Ebene der Ringe verlängert und geneigt. Aufgrund ihres hohen Rechenaufwands können weder der Ansatz von Lit.29 noch von Ref.30 Tausende von Partikeln in angemessener Zeit rekonstruieren. Wir haben kürzlich einen vorlagenfreien und schnellen Partikelfusionsansatz31 eingeführt, der die Einschränkung der Rechengeschwindigkeit überwindet, sodass nun Datensätze von mehreren Tausend Partikeln (oder mehr) für die Strukturanalyse zugänglich sind. In unserem iterativen schnellen Partikelfusionsansatz31 drehen und verschieben wir alle Partikel, um sie an ein Gaußsches Mischungsmodell (GMM) anzupassen, indem wir die JRMPC-Methode (Joint Registration of Multiple Point Clouds)32 verwenden und anschließend die Positionen und Breiten der Gaußschen Zentren aktualisieren. In jeder Iterationsrunde werden sowohl die Partikel als auch das GMM aktualisiert. Aufgrund der inhärenten Einschränkungen der gemeinsamen Registrierungsmethode32 können wir nur eine lokal optimale Ausrichtung der Partikel erzielen, die aus mehreren unterschiedlichen Clustern mit unterschiedlichen Posen bestehen. Anschließend klassifizieren33 wir diese ausgerichteten Partikel mit unterschiedlichen Posen und kombinieren sie erneut, um eine global optimale Lösung zu erhalten, die aus einer einzigen gut ausgerichteten Struktur besteht.

Bisher war das SMLM des NPC in der Lage, die achtfache Rotationssymmetrie aufzudecken, acht Punkte einzeln pro Ring aufzulösen und die Trennung der Kern- und Zytoplasmaringe in 3D darzustellen. Obwohl aus Kryo-EM-Arbeiten15 bekannt ist, dass beispielsweise Nup96 als acht verschiedene Einheiten pro Ring auftreten, wobei eine einzelne Einheit zwei Nup96-Kopien enthält, konnte dies bisher mit herkömmlichem SMLM nicht aufgelöst werden. Hier zeigen wir, dass jeder der acht Blobs tatsächlich zwei Fluorophore enthält, die über ein SNAP-Tag an die Nup96-Einheit gebunden sind, indem wir unsere schnelle templatfreie Partikelmittelungsmethode31 mit einer sorgfältigen Datenanalyse an insgesamt fünf Datensätzen (die aus fünf Kernen von fünf Zellen stammen) kombinieren 4538 NPCs30. Wir haben das Ergebnis unserer Analyse detailliert mit den Kryo-EM-Daten verglichen. Zu diesem Zweck haben wir das von Appen et al.15 um Alphafold34 abgeleitete unvollständige Nup96-Modell erweitert, um die Positionen zu finden, an denen die fluoreszierenden SNAP-Tags voraussichtlich an Nup96 binden. Als nächstes registrierten wir unsere geschätzten Positionen der fluoreszierenden Einheiten mit diesen erwarteten Positionen des SNAP-Tags aus dem Kryo-EM-Modell und stellten fest, dass der durchschnittliche Abstand zwischen den SNAP-Positionen aus dem Kryo-EM-Modell und unserer SMLM-Datenanalyse betrug < 3 nm lateral und 5 nm axial.

Wir haben die im Abschnitt „Methoden“ beschriebenen methodischen Schritte auf fünf Nup96-Datensätze angewendet. Datensatz 1 wurde bereits beschrieben30; Die Datensätze 2–5 stammen aus derselben Zelllinie und demselben Färbe- und Bildgebungsprotokoll. Die Anzahl der analysierten NPCs pro Datensatz beträgt 368, 568, 706, 1178 und 1718, also insgesamt 4538 NPCs. Da die schnelle Partikelfusionsmethode31 zufällig generiertes GMM verwendet und zu unterschiedlichen Rekonstruktionen für denselben Datensatz führt, haben wir den Fusionsprozess zehnmal für jeden Datensatz (einschließlich des kombinierten Datensatzes) durchgeführt, was insgesamt 60 Rekonstruktionen ergab. Anschließend führen wir eine sorgfältige Datenanalyse dieser Rekonstruktionen durch, um unsere Ergebnisse zu erhalten.

In Abb. 1a–c) zeigen wir eine der Superteilchen-Rekonstruktionen des kombinierten Datensatzes bestehend aus 4538 NPCs. In der Draufsicht auf den Kernring (NR) und den Zytoplasmaring (CR) (a, b) ist die Verlängerung der Blobs deutlich zu erkennen. Abbildung 1d) zeigt ein Histogramm der z-Koordinaten der Rekonstruktion in Abb. 1a–c). Die Lokalisierungen von NR und CR sind in den beiden Peaks mit einem Abstand von 48,5 nm sichtbar. Abbildung 1e) zeigt den durchschnittlichen Abstand zwischen den NR- und CR-Z-Histogramm-Peaks für die 5 einzelnen Datensätze und den kombinierten Datensatz. Die Boxplots geben einen Hinweis auf die statistische Verteilung der angepassten Parameter für die 10 unabhängigen Rekonstruktionen, die für jeden der 6 Datensätze durchgeführt wurden. Der untere Whisker des Diagramms reicht bis zum Minimalwert von 46,6 nm, während der obere Whisker bis zum Maximalwert von 49,1 nm reicht. Der Median der Daten beträgt ca. 48,1 nm. In Abb. 1e–g) sind Ausreißer mit dem Sternchen (*) gekennzeichnet.

Als nächstes analysierten wir die Form der 16 einzelnen Blobs in den Rekonstruktionen. Zu diesem Zweck haben wir zunächst eine Routine zum Entfernen von Ausreißerlokalisierungen angewendet (siehe „Methoden“) und so die Anzahl der Lokalisierungen um 32 % reduziert. In Abb. 1f) ist der Medianwert für die Elliptizität konsistent und liegt für alle Datensätze zwischen etwa 0,90 und 0,93. Es gibt einige Ausreißer im Bereich von 0,75 bis 0,85, die unter den Medianwerten liegen. Darüber hinaus scheint es, dass die Längsachsen der Ellipsen mit der Tangente an die Ringe einen mittleren Winkel von etwa \(\pm 5,5^{\circ }\) bilden, mit entgegengesetztem Vorzeichen für CR und NR (Abb. 1g). . Wenn die Elliptizität auf einen Registrierungsfehler oder ein Artefakt des Partikelfusionsverfahrens zurückzuführen wäre, wäre die Längsachse der Ellipsen auf die Tangente der Ringe ausgerichtet. Wir können daher den Schluss ziehen, dass die Neigung der elliptischen Klumpen ungleich Null ein Beweis für ein Strukturmerkmal ist. Die einfachste Erklärung ist, dass jeder elliptische Fleck eine Kombination aus Lokalisierungsereignissen von Emittern ist, die an zwei unterschiedliche Bindungsstellen binden, d. h. die Partikelfusion legt direkt nahe, dass Nup96 in einer Anordnung mit zwei Nup96-Kopien pro Einheit auftritt. Wir stellen fest, dass der Beweis für (mindestens) zwei Bindungsstellen aus der Interpretation des Strukturmerkmals der Elliptizität stammt. Die Bindungsstellen können in den Rekonstruktionen nicht direkt als zwei unterschiedliche Stellen beobachtet werden. Auffällig ist, dass die Blobs im NR ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) haben als die Blobs im CR (Abb. 1c) und das NR im Vergleich zum CR eine deutlich höhere Anzahl an Lokalisationen aufweist, nämlich etwa 22 % mehr Lokalisierungen (Abb. 1d). Dieser Qualitätsunterschied kann durch die Art und Weise verursacht werden, wie die JRMPC-Methode die Daten zusammenführt. Bei einer globalen Optimierung kann eine bessere Registrierung für einen Teil der Struktur (hier NR) auf Kosten der Registrierungsqualität eines anderen Teils der Struktur (hier CR) erreicht werden. Darüber hinaus könnte auch strukturelle Heterogenität zu den beobachteten Unterschieden in der Registrierungsqualität beitragen.

(a–c) Eine der 3D-Rekonstruktionen von Nup96 aus 4538 NPC-Partikeln des kombinierten Datensatzes. Die Ausgaberekonstruktion umfasst alle Eingabepartikel. Die Rekonstruktion löst zwei Ringe und 8 Blobs pro Ring auf. (a) Draufsicht auf den Kernring (NR), (b) Draufsicht auf den Zytoplasmaring (CR), (c) Seitenansicht, (d) Histogramm der Z-Koordinaten der Lokalisierungen in der aus dem kombinierten Datensatz erhaltenen Rekonstruktion, und bimodale Gaußsche Anpassung an die Daten. Der Abstand zwischen den beiden Peaks des Histogramms beträgt 48,5 ± 0,1 nm. (e) Abstand zwischen NR und CR für alle Datensätze. (f) Durchschnittliche Elliptizität e der elliptischen Blobs für NR (blau) und CR (rot), (g) durchschnittlicher Winkel \(\phi \) der Längsachse der elliptischen Blobs mit der Tangente an den Ring in xy -Ebene für NR (blau) und CR (rot) (negative Winkel zeigen eine Drehung im Uhrzeigersinn an). Der Maßstabsbalken in (a) beträgt 40 nm und gilt auch für (b,c).

Wir haben zwei Ansätze untersucht, um die Positionen der beiden Bindungsstellen in den Nup96-Einheiten abzuschätzen. Erstens haben wir eine uneingeschränkte Anpassung von 16 anisotropen Gaußschen Zentren für NR und CR separat verwendet, und zweitens haben wir eine eingeschränkte Anpassung verwendet, bei der wir die achtfache Rotationssymmetrie [gemäß Gl. (1) und (2)].

Positionen der Bindungsstellen, die aus einer uneingeschränkten Anpassung (lila) und aus einer eingeschränkten Anpassung mit achtfacher Symmetrie (rosa) ermittelt wurden. Diese Anpassungen werden aus der in Abb. 1a–c) dargestellten Rekonstruktion des kombinierten Datensatzes erhalten. Draufsicht auf die Bindungsstellen für NR (a) und CR (b). (c) Schrägansicht von CR und NR für die Projektion im Winkel \(15^\circ \) mit der xy-Ebene. Der Maßstabsbalken in (a) gilt auch für (b,c).

Wir haben festgestellt, dass der Abstand zwischen den 16 Bindungsstellen der beiden Anpassungsansätze für die kombinierten Daten \(2,8\pm 1,7\) nm für die NR und \(3,6\pm 1,4\) nm für die CR beträgt (siehe Abb. 2). ). Dieser kleine Unterschied weist darauf hin, dass unsere Daten gut mit der achtzähligen Symmetrie übereinstimmen und dass die Verwendung der Symmetriebeschränkung bei der Anpassung ein gültiges Verfahren ist.

Abbildung 3 zeigt die Strukturparameter (Radius R von CR und NR, Abstand d zwischen den beiden Bindungsstellen in der Einheit, Neigungswinkel außerhalb der Ebene \(\theta \) der Einheit, Neigungswinkel in der Ebene \(\ phi \) der Einheit) für alle Datensätze für den Fall einer symmetriebeschränkten Anpassung. Zum Vergleich zeigen wir auch die Referenzwerte aus den Kryo-EM-Daten (\(R=54\) nm, \(d=11,8\) nm, \(\phi =-32,6^{\circ }\) (NR) , \(\phi =32,1^{\circ }\) (CR), \(\theta =76,8^{\circ }\))15,34. Die aus der symmetriebeschränkten Anpassung erhaltenen Strukturparameter sind zwischen den verschiedenen Rekonstruktionen relativ konsistent und liegen nahe an den Kryo-EM-Referenzwerten. Insbesondere der Radius und der Abstand zwischen den Bindungsstellen in der Einheit passen gut zusammen, wobei die Winkel im Vergleich zum Kryo-EM-Modell etwas abweichen. Es gibt einige Unterschiede zwischen den Datensätzen, wobei die Datensätze 3 und 4 offenbar stärker verstreute Lokalisierungen aufweisen als die anderen, was zu visuell schlechteren Rekonstruktionen für NR und CR führt. Die geschätzten Unsicherheiten der Parameter für die NR sind kleiner als für die CR, was mit der geringeren Rekonstruktionsqualität der CR im Vergleich zur NR übereinstimmt. Der Radius des NR stimmt sehr gut mit dem Kryo-EM-Referenzwert überein, wohingegen der Radius des CR durchweg etwa 2,5 nm kleiner ist. Der geschätzte Abstand zwischen den Bindungsstellen in der Einheit ist etwas kleiner als der Kryo-EM-Referenzabstand. Wir stellen fest, dass der Neigungswinkel in der Ebene für NR und CR das entgegengesetzte Vorzeichen hat, was mit dem Kryo-EM-Modell übereinstimmt. Die geschätzte Größe des Neigungswinkels in der Ebene ist etwas kleiner als die Kryo-EM-Referenzwerte. Eine größere quantitative Nichtübereinstimmung wird für den Neigungswinkel außerhalb der Ebene festgestellt, was wir auf die Lokalisierungsunsicherheit in axialer Richtung zurückführen, die zwei- bis dreimal größer ist als die Unsicherheit in der xy-Ebene35.

Strukturparameter für die achtfache Symmetrie-beschränkte Anpassung für NR (blau) und CR (rot) für alle Datensätze. Die aus dem Kryo-EM-Modell abgeleiteten Parameter der Fluorophorstandorte werden als gestrichelte Linien dargestellt und die aus den SMLM-Ergebnissen identifizierten Ausreißer werden mit dem Sternchen (*) gekennzeichnet. (a) Radius für NR und CR, der NR-Radius beträgt etwa 54,1 nm und der CR-Radius beträgt etwa 51,6 nm. Der Referenzradius beträgt 54,2 nm. (b) Abstand zwischen den Bindungsstellen in den Einheiten. Der Abstand in der Einheit beträgt \(9,7\pm 2,2\) nm und der Referenzwert beträgt 11,8 nm. (c) Winkel außerhalb der Ebene \(\theta \) der Linie, die die beiden Emitter in einer Einheit mit der z-Achse verbindet, \(\theta = 79,1^\circ \pm 7,3^\circ \) und die Referenzwert ist \(\theta =76,8^\circ \). (d) Winkel in der Ebene \(\phi \) der Linie, die die beiden Emitter in der Einheit mit der Tangente des Rings in der xy-Ebene verbindet, \(\phi \sim -12,8\pm 7,0^\circ \ ) für die NR und \(\phi \sim +13,7\pm 7,5^\circ \) für die CR. Der Referenzwinkel beträgt \(-32,6^\circ \) für NR (blaue gestrichelte Linie) und \(32,1^\circ \) für CR (rote gestrichelte Linie). Bei den Feldern (c,d) zeigen positive Winkel eine Drehung gegen den Uhrzeigersinn an.

Abbildung 4 zeigt einen direkten Vergleich zwischen den aus den Kryo-EM-Daten vorhergesagten Positionen der SNAP-Tags und den Positionen der Emitter gemäß den SMLM-Partikelfusionsdaten. Die Emitter von SMLM werden aus den Gesamtsymmetrie-beschränkten Anpassungsparametern generiert, die aus der Mittelung aller 60 Anpassungen erhalten werden. Wir haben den Abstand zwischen den entsprechenden Emittern unserer symmetriebeschränkten Anpassung und den aus der Kryo-EM vorhergesagten SNAP-Tags gemessen. Für die NR finden wir Abstände in der Ebene von 2,1 nm und 2,3 nm und Abstände außerhalb der Ebene von 5,1 nm und 5,0 nm für die beiden Emitterpositionen in der Einheit, für die CR finden wir Abstände in der Ebene von 4,2 nm und 0,4 nm und Abstände außerhalb der Ebene von – 3,5 nm und – 5,2 nm für die beiden Emitterpositionen in der Einheit. Bitte beachten Sie, dass wir die Fluorophorposition nicht direkt in unserem Strukturmodell zuweisen können, das sich auf die Modellierung der SNAP-Tag-Position relativ zu NUP96 beschränkt, während wir die Fluorophorposition direkt in SMLM messen. Der erwartete Abstand zwischen dem SNAP-Tag und der Fluorophorposition beträgt 1–2 nm. Insgesamt ist die Übereinstimmung in der Ebene der NPC-Ringe recht gut, mit einem Gesamtfehler von nur \(2,2\pm 1,4\) nm.

Der laterale Fehler scheint auch frei von einer systematischen Verzerrung zwischen den auf Kryo-EM basierenden und den auf der SMLM-Partikelfusion basierenden Positionsschätzungen zu sein. Dies steht im Gegensatz zu den axialen Positionsschätzungen, bei denen wir einen Abstand zwischen den oberen Emittern im CR und im NR von 48,4 nm und zwischen den unteren Emittern im CR und im NR von 47,3 nm finden. Es scheint, dass die SMLM-Daten einen Abstand zwischen NR und CR ergeben, der systematisch kleiner ist als der aus dem Kryo-EM-Modell erhaltene Abstand, mit einer durchschnittlichen Abweichung der geschätzten NPC-Dicke aus dem Kryo-EM/SMLM-Vergleich von 9,4 nm. Abbildung 1e) zeigt den geschätzten Abstand zwischen NR und CR für alle Datensätze, und Abbildung 1d) zeigt das Histogramm der Z-Koordinaten der 244.946 Lokalisierungen in der aus dem kombinierten Datensatz erhaltenen Rekonstruktion. Wir finden, dass der Abstand zwischen NR und CR im SMLM \(48,0\pm 0,4\) nm beträgt, während der Abstand zwischen den Ringen im EM-Modell \(57,2\pm 0,2\) nm beträgt, was einer Abweichung von etwa 9,2 nm entspricht . Diese Analyse der zugrunde liegenden axialen Lokalisierungsdaten legt nahe, dass die gefundene Verzerrung nicht auf ein Artefakt der Partikelfusionsmethode zurückzuführen ist.

Überlagerung der Fluorophorpositionen aus den SMLM-Partikelfusionsdaten (rosa) und des aus den Kryo-EM-Daten abgeleiteten SNAP-Tags (lila). Für unsere gesamten SMLM-Emitter (rosa) beträgt der seitliche Abstand zwischen einer Einheit 9,1 nm für NR und 10,0 nm für CR. Die axialen Abstände zwischen einer Einheit betragen 2,4 nm für NR und 1,2 nm für CR. Die SNAP-Tags (lila) haben laterale Abstände zwischen einer Einheit von 11,6 nm für NR und 11,5 nm für CR sowie axiale Abstände von 2,5 nm für NR und 2,9 nm für CR.

Insgesamt deutet unsere Analyse der SMLM-Partikelfusion auf eine Nup96-Einheitsstruktur hin, die gut mit den Kryo-EM-Daten übereinstimmt. Im Vergleich zum Kryo-EM-Modell bleibt jedoch eine große Inkonsistenz bestehen. Die Höhe des NPC wird nämlich bei der SMLM-Partikelfusion auf etwa 9 nm geringer geschätzt als bei der Kryo-EM. Ähnliche Ringtrennungswerte für Nup96 wurden in anderen SMLM-Studien36,37 berichtet und weisen eine größere Abweichung vom Kryo-EM-Modell auf als die statistischen Fehler. Es gibt eine Reihe von Faktoren, die zu dieser Diskrepanz beitragen könnten. Erstens könnten die Unterschiede in den Zelllinien und im Funktionszustand der Zellen eine Rolle spielen, da bereits Unterschiede in der Höhe von NPCs in Kryo-ET-Strukturen verschiedener Zelllinien mit einer Höhe von \(\sim \) 5 nm beobachtet wurden Unterschied zwischen in situ NPC beobachtet in HeLa- und HEK-Zellen. Diese Unterschiede könnten unterschiedlichen Funktionszuständen entsprechen, die beispielsweise eine Erweiterung des Innenrings beinhalten3,9. Zweitens werden die axialen Lokalisierungsdaten anhand von Referenzbildern von NPCs kalibriert, die seitwärts ausgerichtet sind. In der Seitenansicht sind die beiden Ringe in der Bildebene deutlich getrennt. Dort ist die Lokalisierungsgenauigkeit viel besser (\(2-3\times)) als in axialer Richtung und der Abstand kann leicht abgeschätzt und zur Kalibrierung der axialen Koordinate verwendet werden37. Die Seitenansichten stammen von NPCs an den Seiten des Kerns, während sich die anderen NPCs in der Kernhülle befinden, die flach auf dem Deckglas aufliegt. Drittens: Wenn die Bewegung des Fluorophors während der Bildgebung (teilweise) eingeschränkt ist, können Dipolausrichtungseffekte bei der Bildgebung einzelner Moleküle einen Einfluss auf die Schätzung der lateralen Position haben, was zu Abweichungen in der Größenordnung von \(\sim \) 10 nm38 führt. Ein Störfaktor ist die Analyse der 3D-SMLM-Daten von Nup107, das im NPC-Gerüst an Nup96 angrenzt und bei der SMLM-Partikelfusion einen Ringabstand von 60 nm aufweist29 – in Übereinstimmung mit den Kryo-EM-Daten. Es ist erwähnenswert, dass die Nup107-Partikel aus einem anderen Experiment gewonnen wurden, bei dem sich die Zelllinie und der Funktionszustand der Zelle von den in diesem Artikel analysierten Datensätzen unterschieden.

Die geschätzten Strukturparameter für die NR scheinen zwischen den Datensätzen konsistenter zu sein als für die CR (siehe Abb. 3). Wir führen dies darauf zurück, dass die Lokalisationen des CR stärker gestreut sind und das rekonstruierte Superteilchen dort wiederum von geringerer Qualität ist. Der zugrunde liegende Grund könnte darin liegen, dass die 3D-Partikelfusion die Ausrichtung eines Rings begünstigt, wodurch der andere Ring unschärfer wird – insbesondere in axialer Richtung. Ein möglicher Verbesserungspunkt könnte darin bestehen, die Lokalisierungen im CR durch unsere Partikelfusionsmethode separat neu zu registrieren, was letztendlich zu einer Rekonstruktion des CR mit besserer Qualität führen könnte.

Auch weitere technische Verbesserungen der Datenanalyse sind denkbar. Erstens erfolgt die Entfernung von Ausreißerlokalisierungen nun über eine Kaskade aus der Hinzufügung eines zusätzlichen Gaußschen Zentrums zum GMM und der anschließenden Filterung von Lokalisierungen entsprechend der Lokalisierungsdichte. Ein einziger integrierter Ansatz kann die Robustheit des Datenanalyseverfahrens verbessern. Zweitens könnten anfängliche Parametereinstellungen zu einer besseren Konvergenz zu globalen Optima der GMM-Anpassung führen. Eine grundlegendere Verfeinerung der aktuellen Analyse betrifft die Modellauswahl. Die aktuelle Analyse stützt sich auf das einfachste Modell, das die Beobachtungen erklären kann, nämlich dass das Nup96 in einer Einheitsstruktur aus zwei Kopien erscheint. Eine mögliche Verbesserung könnte daher in einem statistischen Kriterium liegen, das belegt, dass es im NPC 32 Emittenten gibt, im Gegensatz zu einem weiteren Vielfachen von 16.

Kürzlich spekulierten Helmerich et al.39, dass Fluorophore in Abständen unter etwa 10 nm mit SMLM nicht zuverlässig aufgelöst werden können, obwohl die Präzision des Mikroskops, der Datenanalyse-Pipeline und der beobachteten Einzelmolekül-Photonenzählung eine solche Unterscheidung ermöglichen sollte. Es wird angenommen, dass der Energietransfer zwischen benachbarten Fluorophoren zu einer erneuten Anregung der Emitter zu Beginn des Experiments und anschließendem Ausbleichen beider führt, wodurch eine individuelle Beobachtung der Emitter, wie sie für SMLM erforderlich ist, verhindert wird. Insbesondere mit der Einführung von MINFLUX und verwandten Techniken36,40,41,42, die eine Lokalisierungsgenauigkeit im Nanometerbereich bei geringer Photonenzahl bieten, könnten diese Beobachtungen außer in seltenen Fällen die direkte Abbildung der Einheitstrennung im NPC vereiteln und eine sorgfältige Datenanalyse, wie hier dargestellt, erfordern als einziges verbleibendes Werkzeug43. Gwosch et al.44 verschmolzen 162 NPC-Partikel, die aus den MINFLUX-Daten von36 erhalten wurden, mit der All-to-All-Partikelfusionsmethode29. Ihr Ergebnis bildet nicht die hier gezeigte Einheitenstruktur ab. Dies kann auf eine Reihe von Faktoren zurückzuführen sein, beispielsweise auf eine geringe Markierungsdichte oder wenige Lokalisierungen pro Partikel.

Erst kürzlich hat eine neuartige DNA-Barcoding-Methode, „Resolution Enhancement by Sequential Imaging“ (RESI), die Lokalisierungsgenauigkeit deutlich verbessert45. Durch die Anwendung der datengesteuerten Durchschnittsmethode30, um eine Fusion von 1217 Partikeln zu ergeben, konnten einzelne Nup96-Proteine ​​innerhalb einer Einheit unterschieden werden. Der laterale und axiale Abstand betrugen 11,9 ± 1,2 nm bzw. 5,4 ± 0,4 nm. Diese Werte sind etwas größer als die Werte, die wir aus unserer symmetriebeschränkten Anpassung in Abb. 4 erhalten haben. Wir haben den Neigungswinkel und die Elliptizität jedes Blobs an der Längsachse anhand von Abb. 2g des RESI-Papiers gemessen. Wir haben für den CR herausgefunden, dass der Neigungswinkel \(-9,3 \pm 3,1^{\circ }\) beträgt, während für den NR der Neigungswinkel \(5,9 \pm 1,6^{\circ }\) beträgt. Im Vergleich dazu gibt Abb. 1g mittlere Neigungswinkel von ± 5,5\(^{\circ }\) für die CR- und NR-Blobs mit entgegengesetztem Vorzeichen an. Der scheinbare Unterschied in der Händigkeit der Struktur, d. h. dem Vorzeichen des Neigungswinkels in der Ebene, der RESI-Ergebnisse im Vergleich zu unseren Ergebnissen und denen von Lit. 30 ist auf einen Unterschied in der Projektion zurückzuführen (von der CR-Seite aus betrachtet vs. betrachtet). von der NR-Seite). Die durchschnittliche Elliptizität für die CR- und NR-Blobs im RESI-Ergebnis beträgt 0,86 ± 0,02 bzw. 0,88 ± 0,03. Aus Abb. 1f geht hervor, dass die Elliptizität für die CR- und NR-Blobs in guter Übereinstimmung zwischen 0,90 und 0,93 liegt. Insgesamt sind die Schlussfolgerungen zur Einheitsstruktur ähnlich, Unterschiede können auf biologische Variationen und Unterschiede in den Bildgebungsbedingungen zurückgeführt werden.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass SMLM 3D-Strukturen im kleinen Nanometerbereich sichtbar machen kann. Unsere hochauflösenden Partikelfusionsrekonstruktionen und die anschließende Datenanalyse ermöglichten die genaue Schätzung der Positionen von 32 Emitterbindungsstellen für Nup96 im NPC. Der Vergleich mit Kryo-EM-Daten zeigt eine Konsistenz von besser als 2,5 nm seitlich, aber auch eine Abweichung bei der NPC-Höhenschätzung von etwa 9,2 nm. Die letztgenannte Inkonsistenz ist kaum verstanden und erfordert weitere Untersuchungen durch die Forschungsgemeinschaft.

Wir haben unsere zuvor veröffentlichte Partikelmittelungsmethode31 auf fünf NPC-SMLM-Datensätze einzeln und alle fünf zusammen (insgesamt 4538 NPCs) angewendet. Datensatz 1 mit 368 NPCs wurde bereits beschrieben30 und die anderen Datensätze wurden unter den gleichen experimentellen Bedingungen erhalten. Jeder Datensatz entspricht einer einzelnen Zelle. Unsere schnelle Partikelfusionsmethode richtet zunächst die Eingabepartikel gemeinsam mit einem zufällig generierten Gaußschen Mischungsmodell (GMM) aus. Die Anzahl der Gaußschen Komponenten und die anfängliche Gaußsche Standardabweichung des GMM werden für eine bessere Konvergenz im iterativen Optimierungsschritt32 voreingestellt. Da die gemeinsame Registrierung bei einem lokalen Optimum abgefangen werden kann, das mehrere Partikelgruppen (Cluster) mit unterschiedlichen überlappenden Posen in der Rekonstruktion enthält, wenden wir eine unbeaufsichtigte Klassifizierungsmethode33 an, um diese Cluster zu trennen und den Cluster wieder mit derselben Pose zu verbinden. Wir verwenden die in31 angegebenen Standardwerte für den Datenfusionsalgorithmus, mit Ausnahme der Anzahl der Gaußschen Komponenten K im Gaußschen Mischungsmodell (GMM) und der anfänglichen Gaußschen Standardabweichung der Gaußschen Komponenten. Wir setzen \(K=34\), das heißt 32 Gaußsche Komponenten für 32 Bindungsstellen und 2, um falsch positive Lokalisierungen des Kernrings und des Zytoplasmarings zu berücksichtigen. Die anfänglichen Posen der NPC-Partikel (Längsachse des Zylinders) sind grob an der optischen Achse ausgerichtet, da die Kernmembran entlang des Deckglases verläuft. Wir können damit eine anfängliche Gaußsche Standardabweichung auf 33 nm festlegen, die kleiner als die Gesamtgröße des NPC ist, um die Konvergenz des Algorithmus zu beschleunigen. Wir haben für jeden Datensatz zehnmal eine Partikelmittelung durchgeführt und so insgesamt 60 Superpartikel erhalten, um die durch das zufällig generierte GMM induzierte statistische Variabilität in die Analyse einzubeziehen. Alle im Anhang gezeigten Superteilchen weisen in allen 5 Datensätzen sowie im kombinierten Datensatz durchweg zwei Ringe auf, von denen jeder 8 elliptisch geformte Klumpen enthält.

Wir erhalten Superteilchen aus der Partikelmittelung der verschiedenen Datensätze, die dieselbe Form, aber unterschiedliche absolute Posen im 3D-Raum haben. Für einen besseren Vergleich und eine einfachere Analyse richten wir ihre globale Pose so aus, dass die Ringe senkrecht zur Z-Achse unseres globalen Koordinatensystems stehen. Wir tun dies, indem wir die Superteilchen in einer festen Vorlage registrieren, die zwei Ringe hat und jeder Ring acht Punkte mit achtfacher Rotationssymmetrie enthält. Der Mittelpunkt der Vorlage liegt im Ursprung des Koordinatensystems. Der Abstand zwischen den beiden Ringen in der Vorlage beträgt 50 nm und der Radius jedes Rings beträgt 55 nm. Schließlich drehen wir die Superteilchen um die x- und y-Achse von \(-3^\circ \) bis \(3^\circ \) in Schritten von \(0,2^\circ \), um den minimalen Vollwert zu finden Halbwertsbreite (FWMH) des Histogramms der Z-Koordinaten. Anschließend teilen wir das Superteilchen zur weiteren Analyse entsprechend ihrer Z-Koordinaten in zwei 8-Blob-Ringe auf. Diese Ringe stellen den Kernring (NR) und den Zytoplasmaring (CR) des NPC dar.

Als nächstes entfernen wir Ausreißerlokalisierungen in jedem Ring. Zu diesem Zweck verwenden wir alle Lokalisierungen in einem Ring und passen ein zufällig initialisiertes GMM mit 9 Gaußschen Komponenten an, wobei wir wiederum die JRMPC-Methode verwenden. In der xy-Ebene werden alle GMM-Zentren zufällig innerhalb einer 2D-Box mit einem Durchmesser von 100 nm generiert. Die Z-Koordinaten dieser anfänglichen Gaußschen Zentren werden auf 0 gesetzt. Die Standardabweichungen der anfänglichen Gaußschen Komponenten werden auf 33 nm gesetzt. Somit ist ein anfängliches GMM, bei dem sich alle Gaußschen Komponenten in der Nähe der Lokalisierungen befinden und vergleichbare Standardabweichungen zur Größe des Rings aufweisen, für die Konvergenz von JRMPC geeignet. In allen Fällen stellen wir fest, dass es 8 Komponenten mit ähnlichen (kleinen) Standardabweichungen und eine Komponente mit einer großen Standardabweichung gibt, was auf die Ausreißerkomponente hinweist. Wir entfernen die Lokalisierungen in der letztgenannten Komponente aus den Daten (das sind etwa 5 % der Anzahl der Lokalisierungen). Da die automatisierte Datenanalyse empfindlich auf Ausreißerlokalisierungen reagiert, wenden wir eine weitere Ausreißerfilterung basierend auf der Dichte der Lokalisierungen in den Blobs an. Wir entfernen alle Lokalisierungen mit einer lokalen Dichte, die kleiner als ein Schwellenwert ist, sodass jeder Blob in der Rekonstruktion klar von seinen benachbarten Blobs getrennt ist. Wir haben mit verschiedenen Dichteschwellenwerten experimentiert und festgestellt, dass ein Wert von 95 % der mittleren Dichte eines einzelnen Blobs für alle Rekonstruktionen geeignet ist. Dieser letztere Vorgang entfernt etwa 1/3 der Lokalisierungen.

Die Längsachsen der elliptisch geformten Kleckse in einem Ring sind gegenüber dem Ringumfang geneigt. Um dies weiter zu untersuchen, messen wir die Elliptizität jedes projizierten Blobs auf die xy-Ebene. Die Elliptizität ist definiert als \(e=b/a\), wobei a und b die Längen der langen bzw. kurzen Achse sind. Wir messen auch den Neigungswinkel zwischen der Längsachse jedes Blobs und der Tangente an den gesamten 2D-Ring. Anschließend berechnen wir die Verteilung der Elliptizität und des Neigungswinkels über den Wertesatz für die 8 Blobs der 10 Rekonstruktionen in jedem Ring.

Die Neigung der elliptischen Form der Blobs gegenüber den Ringen weist darauf hin, dass mehr als ein Emitter pro Blob vorhanden ist. Da darüber hinaus auch der Neigungswinkel für NR und CR ein entgegengesetztes Vorzeichen hat, handelt es sich bei der Neigung nicht um ein Rekonstruktionsartefakt. Die Einheit aus zwei Nup96 ist jedoch aufgrund der begrenzten Lokalisierungsgenauigkeit, Restdrift oder Registrierungsfehler nicht auflösbar. Wir gehen davon aus, dass es zwei SNAP-Emitter pro Blob gibt, basierend auf dem Vorwissen aus dem Kryo-EM-Modell, dass es zwei Nup96-Kopien pro Blob gibt. Wir verwenden erneut ein GMM mit 16 Komponenten, um die 8 Blobs pro Ring anzupassen, und interpretieren die Zentren der Gaußschen Komponenten als die Positionen der Emitter. Für das Anpassungsverfahren verwenden wir die folgende Heuristik: Die anfängliche Standardabweichung für die Gaußsche Anpassung ist in x- und y-Richtung (in der Ebene) gleich, in z-Richtung (die auf die optische Achse ausgerichtet ist) jedoch doppelt so groß. , da die axiale Lokalisierungsunsicherheit typischerweise zwei- bis dreimal größer ist als in der xy-Ebene35. Darüber hinaus gehen wir davon aus, dass alle Nup96-Einheiten in einem Ring identisch sind, dh die Gaußschen Komponenten im GMM haben identische diagonale Kovarianzmatrizen.

Wir verwenden die iterative Erwartungsmaximierung (EM), um das optimale GMM zu finden, indem wir die Wahrscheinlichkeit maximieren, dass das GMM zu den Lokalisierungen passt46. Die gemeinsamen diagonalen Kovarianzmatrizen, Zentren der Gaußschen Komponenten und Posterior-Wahrscheinlichkeiten der Komponentenmitgliedschaften sind die Anpassungsparameter und werden iterativ aktualisiert. Die aus der Anpassung des 16 anisotropen Gaußschen Mischungsmodells erhaltenen Gaußschen Zentren werden durch \(G=\{\textbf{g}_i\}_{i=1}^{16}\) mit \({\textbf{g}_i) dargestellt }=(g_{ix},g_{iy}, g_{iz})\).

Wir haben eine zweite Anpassungsmethode verwendet, um die achtfache Symmetrie zu nutzen, da die uneingeschränkte anisotrope GMM-Anpassung empfindlich auf die Einstellung der anfänglichen Gaußschen Zentren reagiert. Zu diesem Zweck generieren wir für jeden Ring 16 Punkte mit achtzähliger Symmetrie als Anfangszentren der anisotropen GMM-Anpassung (siehe Abb. 5). Die 16 Bindungsstellen, die durch die Punktmenge \(S=\{\{\textbf{s}_{kj}\}_{j=1}^{2}\}_{k=1}^{8} definiert sind \) werden durch 6 Parameter charakterisiert: (\(c_{1x}\), \(c_{1y}\), \(c_{1z}\), d, \(\theta \), \(\phi \ )), wobei \({\textbf{c}_1}=\left( c_{1x}, c_{1y}, c_{1z}\right) \) der Mittelpunkt des ersten (\(k=1\) ist )) Einheit, d ist der Abstand zwischen den beiden Bindungsstellen in der Einheit, \(\theta \) ist der Winkel zwischen der Linie, die die beiden Bindungsstellen in einer Einheit verbindet, und der positiven z-Achse (\(0\le \ theta \le \pi \)), und \(\phi \) ist der Winkel zwischen der Projektion dieser Linie auf die xy-Ebene und der Tangente des Rings in der xy-Ebene (\(0\le \phi \le 2\pi \)). Die Koordinaten des Einheitszentrums in der Ebene können wie folgt parametrisiert werden: \({\textbf{c}_1}=\left( c_{1x}, c_{1y}\right) =R\left( \cos \psi ,\ sin \psi \right) \), wobei R der Radius des Rings und \(\psi \) der Winkel in der Ebene ist. Die Koordinaten der beiden Bindungsstellen in der ersten Einheit sind somit gegeben durch:

Wir wählen Emitter 1 als den Emitter, der über der Mittelebene des Rings liegt, d. h. wir beschränken den Polarwinkel auf \(0\le \theta \le \pi /2\). Die Koordinaten der Bindungsstellen der \(k=2,\dots ,8\) anderen Einheiten können durch Drehen dieser Punkte um \((k-1)\pi /4\) in der xy-Ebene abgeleitet werden. Die Parameter für die anfänglichen GMM-Zentren sind (0, 53,5 nm, ± 24 nm, 13 nm, \(\pi /2, \pi /4\)), wobei \(+\) NR und − CR entspricht. Der In-Plane-Winkel \(\phi \) wird zufällig im Intervall 0 bis \(\pi \) generiert. Wir finden die Parameter der symmetriebeschränkten Punktmengen S aus den Koordinaten der unbeschränkten Punktmenge G, indem wir den mittleren quadratischen Fehler zwischen den Punktmengen S und G mit der in MATLAB implementierten Quasi-Newton-Methode47 minimieren.

Schematische Darstellung der Strukturparameter der 8 Paare von zwei Bindungsstellen mit insgesamt achtzähliger Symmetrie. Der rote Punkt ist die Mitte des ersten Paares und die blauen Punkte sind die Bindungsstellen in den Einheiten.

Um die gefundenen Emitterpositionen mit den verfügbaren Strukturdaten des menschlichen NPC15 in Beziehung zu setzen, haben wir die Nup96-Struktur in voller Länge mit Alphafold234 modelliert und den SNAP-Tag an der Carboxyl-terminalen Position der Nup96s hinzugefügt. Wir haben das Nup96 in voller Länge mit einem starren Körper in die Kryo-EM-Dichte eingepasst und dabei die Reste 881–1817 aus PDB ID 5a9q als Ankerreste verwendet15. Wie erwartet ragt das SNAP-Tag aus der NPC-Baugruppe heraus und unterstützt so die korrekte Platzierung. Anschließend haben wir das angepasste Modell symmetrieerweitert, um die vollständige NPC-Anordnung zu generieren und den Massenschwerpunkt des O\(^{6}\)-Benzylguanin-AF647 (BG-AF647) zu bezeichnen, um die Emitterposition darzustellen.

Um die Kryo-EM- und SMLM-Modelle abzugleichen, haben wir zunächst die Parameter der SNAP-Tags aus dem Kryo-EM-Modell gemessen. Anschließend haben wir die SNAP-Tags im EM-Modell und die gesamten achtfach symmetrischen Emitterpositionen in den SMLM-Rekonstruktionen anhand ihrer Anpassungsparameter einzeln neu generiert und dabei sichergestellt, dass sie dasselbe Zentrum wie die erste Einheit haben. Die vorhergesagten SNAP-Tag-Positionen basierend auf dem Kryo-EM-Modell werden durch Positionsvektoren \({\textbf{m}_{kj}}=(m_{kj,x},m_{kj,y}, m_{kj, z})\) für \(k=1,\ldots 8\) und \(j=1,2\). Unter Verwendung dieses Satzes von Positionsvektoren werden Referenzwerte für den Radius R des CR und NR, den Abstand d zwischen den beiden Bindungsstellen in der Einheit, den Neigungswinkel \(\phi \) der Einheit in der Ebene und die Außen- Der Neigungswinkel \(\theta\) der Einheit in der Ebene kann aus Gleichungen ähnlich den Gleichungen erhalten werden. (1) und (2).

Die beiden Modelle können direkt verglichen werden, indem der planare und axiale Abstand der Kryo-EM-SNAP-Tag-Positionen zu den geschätzten Emitterpositionen aus der SMLM-Partikelfusion berechnet wird:

Da die Kryo-EM-Daten konstruktionsbedingt die achtfache Rotationssymmetrie erfüllen, vergleichen wir nur die Kryo-EM-SNAP-Tag-Positionen mit den geschätzten Emitterpositionen aus der SMLM-Partikelfusion, die aus den symmetriebeschränkten Einheitsanpassungen erhalten werden. Das bedeutet, dass es nur vier unterschiedliche Werte für \(b_{xy,jk}\) und vier unterschiedliche Werte für \(b_{z,jk}\) gibt (CR und NR, zwei Emitterpositionen pro Einheit).

Der Datensatz und die Quellcodes für diese Arbeit sind öffentlich verfügbar unter https://github.com/wexw/Particle-fusion-Nup96.git.

Hampoelz, B., Andres-Pons, A., Kastritis, P. & Beck, M. Struktur und Aufbau des Kernporenkomplexes. Annu. Rev. Biophys. 48, 515–536. https://doi.org/10.1146/annurev-biophys-052118-115308 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lin, DH & Hoelz, A. Die Struktur des Kernporenkomplexes (ein Update). Annu. Rev. Biochem. 88, 725–783. https://doi.org/10.1146/annurev-biochem-062917-011901 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Petrovic, S. et al. Struktur und Funktion des Kernporenkomplexes. Kalter Frühling Harb. Perspektive. Biol. 14, a041264. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a041264 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zila, V. et al. Kegelförmige HIV-1-Kapside werden durch intakte Kernporen transportiert. Zelle 184, 1032–1046. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.01.025 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

D'Angelo, MA Kernporenkomplexe als Knotenpunkte für die Genregulation. Kern 9, 142–148. https://doi.org/10.1080/19491034.2017.1395542 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stewart, M. Polyadenylierung und Kernexport von mRNAs. J. Biol. Chem. 294, 2977–2987. https://doi.org/10.1074/jbc.REV118.005594 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wing, CE, Fung, HYJ & Chook, YM Karyopherin-vermittelter nukleozytoplasmatischer Transport. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 23, 307–328. https://doi.org/10.1038/s41580-021-00446-7 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bley, CJ et al. Architektur der zytoplasmatischen Fläche der Kernpore. Wissenschaft 376, eabm9129. https://doi.org/10.1126/science.abm9129 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mosalaganti, S. et al. KI-basierte Strukturvorhersage ermöglicht eine integrative Strukturanalyse menschlicher Kernporen. Wissenschaft 376, eabm9506. https://doi.org/10.1126/science.abm9506 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schuller, AP et al. Die zelluläre Umgebung prägt die Architektur des Kernporenkomplexes. Natur 598, 667–671. https://doi.org/10.1038/s41586-021-03985-3 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Petrovic, S. et al. Architektur des Linker-Gerüsts in der Kernpore. Wissenschaft 376, eabm9798. https://doi.org/10.1126/science.abm9798 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kosinski, J. et al. Molekulare Architektur des inneren Ringgerüsts des menschlichen Kernporenkomplexes. Wissenschaft 352, 363–365. https://doi.org/10.1126/science.aaf0643 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lin, DH et al. Architektur des symmetrischen Kerns der Kernpore. Wissenschaft 352, aaf1015. https://doi.org/10.1126/science.aaf1015 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ori, A. et al. Zelltypspezifische Kernporen: Ein typisches Beispiel für die kontextabhängige Stöchiometrie molekularer Maschinen. Mol. Syst. Biol. 9, 648. https://doi.org/10.1038/msb.2013.4 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Appen, AV et al. In-situ-Strukturanalyse des menschlichen Kernporenkomplexes. Natur 526, 140–143. https://doi.org/10.1038/nature15381 (2015).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Hsia, K.-C., Stavropoulos, P., Blobel, G. & Hoelz, A. Architektur einer Hülle für die Kernporenmembran. Zelle 131, 1313–1326. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.11.038 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stuwe, T. et al. Architektur der Kernporenkomplexschicht. Wissenschaft 347, 1148–1152. https://doi.org/10.1126/science.aaa4136 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Verdammt, SW-Mikroskopie und ihr Fokusschalter. Nat. Methoden 6, 24–32. https://doi.org/10.1038/nmeth.1291 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Klein, T., Proppert, S. & Sauer, M. Acht Jahre Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie. Histochem. Zellbiol. 141, 561–575. https://doi.org/10.1007/s00418-014-1184-3 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vicidomini, G., Bianchini, P. & Diaspro, A. STED superaufgelöste Mikroskopie. Nat. Methoden 15, 173–182. https://doi.org/10.1038/nmeth.4593 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lelek, M. et al. Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie. Nat. Rev. Methods Primers 1, 39. https://doi.org/10.1038/s43586-021-00038-x (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Löschberger, A. et al. Superauflösende Bildgebung visualisiert die achtfache Symmetrie von gp210-Proteinen um den Kernporenkomplex und löst den zentralen Kanal mit Nanometerauflösung auf. J. Cell Sci. 125, 570–575. https://doi.org/10.1242/jcs.098822 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Szymborska, A. et al. Kernporengerüststruktur, analysiert durch hochauflösende Mikroskopie und Partikelmittelung. Wissenschaft 341, 655–658. https://doi.org/10.1126/science.1240672 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Broeken, J. et al. Auflösungsverbesserung durch 3D-Partikelmittelung in der Lokalisierungsmikroskopie. Methoden Appl. Fluoresz. 3, 014003. https://doi.org/10.1088/2050-6120/3/1/014003 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gray, RD et al. Virusmapper: Open-Source-Nanokartierung der Virusarchitektur durch hochauflösende Mikroskopie. Wissenschaft. Rep. 6, 1–8. https://doi.org/10.1038/srep2913 (2016).

Artikel Google Scholar

Löschberger, A., Franke, C., Krohne, G., van de Linde, S. & Sauer, M. Korrelative hochauflösende Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie des Kernporenkomplexes mit molekularer Auflösung. J. Cell Sci. 127, 4351–4355. https://doi.org/10.1242/jcs.156620 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Curd, AP et al. Nanoskalige Musterextraktion aus relativen Positionen spärlicher 3D-Lokalisierungen. Nano Lett. 21, 1213–1220. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c03332 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heydarian, H. et al. Templatefreie 2D-Partikelfusion in der Lokalisierungsmikroskopie. Nat. Methoden 15, 781–784. https://doi.org/10.1038/s41592-018-0136-6 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Heydarian, H. et al. 3D-Partikelmittelung und Nachweis makromolekularer Symmetrie in der Lokalisierungsmikroskopie. Nat. Komm. 12, 1–9. https://doi.org/10.1038/s41467-021-22006-5 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Wu, Y.-L. et al. Maximum-Likelihood-Modellanpassung zur quantitativen Analyse von SMLM-Daten. Nat. Methodenhttps://doi.org/10.1038/s41592-022-01676-z (2022).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, W., Heydarian, H., Huijben, TAPM, Stallinga, S. & Rieger, B. Gemeinsame Registrierung mehrerer Punktwolken für die schnelle Partikelfusion in der Lokalisierungsmikroskopie. Bioinformatik 38, 3281–3287. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btac320 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Evangelidis, GD & Horaud, R. Gemeinsame Ausrichtung mehrerer Punktmengen mit Batch- und inkrementeller Erwartungsmaximierung. IEEE Trans. Muster Anal. Mach. Intel. 40, 1397–1410. https://doi.org/10.1109/TPAMI.2017.2717829 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

Huijben, TAPM et al. Erkennung struktureller Heterogenität in Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopiedaten. Nat. Komm. 12, 1–8. https://doi.org/10.1038/s41467-021-24106-8 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Jumper, J. et al. Hochpräzise Vorhersage der Proteinstruktur mit AlphaFold. Natur 596, 583–589. https://doi.org/10.1038/s41586-021-03819-2 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rieger, B. & Stallinga, S. Die laterale und axiale Lokalisierungsunsicherheit in der hochauflösenden Lichtmikroskopie. ChemPhysChem 15, 664–670. https://doi.org/10.1002/cphc.201300711 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gwosch, KC et al. Die MINFLUX-Nanoskopie liefert eine mehrfarbige 3D-Nanometerauflösung in Zellen. Nat. Methoden 17, 217–224. https://doi.org/10.1038/s41592-019-0688-0 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Thevasthasan, J. et al. Kernporen als vielseitige Referenzstandards für die quantitative Superauflösungsmikroskopie. Nat. Methoden 16, 1045–1053. https://doi.org/10.1038/s41592-019-0574-9 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Stallinga, S. & Rieger, B. Genauigkeit des Gaußschen Punktspreizungsfunktionsmodells in der 2D-Lokalisierungsmikroskopie. Opt. Express 18, 24461–24476. https://doi.org/10.1364/OE.18.024461 (2010).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Helmerich, D. et al. Die photoschaltende Fingerabdruckanalyse umgeht die 10-nm-Auflösungsbarriere. Nat. Methoden 19, 986–994. https://doi.org/10.1038/s41592-022-01548-6 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Balzarotti, F. et al. Bildgebung und Verfolgung fluoreszierender Moleküle mit Nanometerauflösung und minimalem Photonenfluss. Wissenschaft 355, 606–612. https://doi.org/10.1126/science.aak9913 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Cnossen, J. et al. Lokalisierungsmikroskopie mit doppelter Präzision und strukturierter Beleuchtung. Nat. Methoden 17, 59–63. https://doi.org/10.1038/s41592-019-0657-7 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jouchet, P. et al. Nanometrische axiale Lokalisierung einzelner fluoreszierender Moleküle mit modulierter Anregung. Nat. Photonik 15, 297–304. https://doi.org/10.1038/s41566-020-00749-9 (2021).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Prakash, K. & Curd, AP Bewertung von 3D-Minflux-Daten für die quantitative Strukturbiologie in Zellen. Nat. Methoden 20, 48–51. https://doi.org/10.1038/s41592-022-01694-x (2023).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gwosch, KC et al. Antwort an: Auswertung von 3D-Minflux-Daten für die quantitative Strukturbiologie in Zellen. Nat. Methoden 20, 52–54. https://doi.org/10.1038/s41592-022-01695-w (2023).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Reinhardt, SC et al. Fluoreszenzmikroskopie mit Ångström-Auflösung. Natur 617, 711–716. https://doi.org/10.1038/s41586-023-05925-9 (2023).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McLachlan, G. & Peel, D. Finite Mixture Models (Wiley, 2000).

Buchen Sie MATH Google Scholar

Shanno, DF Konditionierung von Quasi-Newton-Methoden zur Funktionsminimierung. Mathematik. Berechnen. 24, 647–656. https://doi.org/10.1090/S0025-5718-1970-0274029-X (1970).

Artikel MathSciNet MATH Google Scholar

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Diese Arbeit wurde vom niederländischen Forschungsrat (NWO) unterstützt, VICI Grant No. 17046 für BR und WW

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Sjoerd Stallinga und Bernd Rieger.

Fakultät für Angewandte Wissenschaften, Technische Universität Delft, Delft, Niederlande

Wenxiu Wang, Arjen Jakobi, Sjoerd Stallinga & Bernd Rieger

Abteilung für Zellbiologie und Biophysik, Europäisches Labor für Molekularbiologie (EMBL), Heidelberg, Deutschland

Yu-Le Wu

Abteilung für Chromosomenbiologie, Universität Wien, Max-Perutz Labs, Zentrum für Molekularbiologie, Wien, Österreich

Jonas Ries

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WW führte numerische Analysen und Modellanpassungen durch. AJ lieferte die Analyse der Kryo-EM-Daten. JR und YW haben die Nup96-SNAP SMLM-Daten erfasst. SS und BR überwachten die Studie. Alle Autoren haben zum Verfassen der Arbeit beigetragen.

Korrespondenz mit Sjoerd Stallinga oder Bernd Rieger.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wang, W., Jakobi, A., Wu, YL. et al. Partikelfusion von hochauflösenden Daten enthüllt die Einheitsstruktur von Nup96 im Kernporenkomplex. Sci Rep 13, 13327 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39829-5

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Eingegangen: 25. April 2023

Angenommen: 31. Juli 2023

Veröffentlicht: 16. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39829-5

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